近日，北京化工大学团队揭示了 λ 外切酶（λExo）的一种新特性，提出了一种能够用于双链核酸识别的新工具，并表明 λExo–pDNA 具有良好的靶向特异性。
与此同时，本次成果还表明：λExo-pDNA 不需要任何特定的基序，与前间隔序列邻近基序（PAM，protospacer adjacent motif）限制的 Cas 蛋白相比具有更强的靶向能力和出色的靶序列特异性。
总的来说，本次研究涉及到 λExo-pDNA 入侵双链 DNA 的基础生物学知识，克服了 CRISPR 设计和前间隔序列邻近基序限制的一些挑战。
基于此，研究人员还开发了一款基因传感器。通过利用 λExo-pDNA 能够进行等温扩增，从而能够提高传感器灵敏度，并有可能与已有的基于 CRISPR 的诊断技术相媲美。
未来，有望在分子诊断、合成 DNA 电路和基因组成像方面发挥作用。
课题组表示，根据目前 λExo 的性质，可以实现快速分子诊断、基因原位成像，效果能够媲美或超过以 CRISPR 为核心的分子诊断技术（例如 SHERLOCK 等）。
针对该酶进行定点突变或定向进化之后，还有望实现基因表达干预与基因编辑，拓展目前基因靶向识别与干预的工具箱，进而开发一系列的生物医学应用。
研究人员表示，双链核酸的特异性靶向识别，是生命科学领域的核心技术。基因编辑、基因检测都依赖于核酸的靶向识别。
然而，目前以 TALEN 为代表的技术，过程复杂、通用性差。以 Ago 蛋白为核心的技术需要高温，难以用于生命体系。以 CRISPR-Cas 蛋白为核心的技术，存在序列局限性、以及脱靶效应等不足。以上限制给分子诊断和病理成像等应用带来了长期困扰。
该课题组长期致力于研究多种自然界中存在的核酸修饰酶（包括核酸外切酶、核酸内切酶、连接酶、甲基转移酶等），在与这些酶打交道的过程中，发现它们与核酸底物的相互作用、以及催化活性非常有特色。
因此，该团队坚信一定存在某种核酸修饰酶可以解决以上问题。基于此，课题组开展了本次研究。
一开始，他们运用单分子荧光、凝胶电泳等手段对 λExo 为代表的核酸外切酶的活性进行深度表征，并重点关注这类酶与底物 DNA 的反应动力学、反应热力学以及反应产物的结构。
在此基础上，运用这类核酸外切酶对多种类型的 DNA 底物进行操控。
在一次设计中，课题组在使用 λExo 与 DNA 底物进行反应时，得到了意料之外的反常现象。
当时做实验的研究生汇报这种现象后，认为这种酶的活性与预期不同，不适合进一步使用。
但是课题组经过细致的讨论之后，认为这种现象如果能够重复，也可能带来更好的效果，该团队负责人鼓励该研究生不要放弃，继续钻研。
后来，这名研究生进一步通过多种类型的实验，包括荧光反应、凝胶电泳等，对反常现象进行验证。
值得庆幸的是，这种反常现象并非一次实验的偶然结果，是可以被重复出来的，而且多种类型的实验都可以验证这一现象。
因此，他们相信这并非偶然现象，背后一定有尚未发现的酶与底物作用的新机制。
接下来，他们换了一种思路，专心研究这种非预设的结果，通过多种类型的实验反复验证，最终确定发现了 λExo 在 5′磷酸化单链 DNA 的引导下靶向核酸序列的新性质，并且开发了核酸分子诊断、DNA 电路、基因组位点原位成像等应用。
在目标物范围、反应温度、操作流程上超越 CRISPR、Ago、TALEN 等技术。
日前，相关论文以《噬菌体 λ 核酸外切酶和 5′-磷酸化 DNA 引导物允许非 PAM 依赖地靶向双链核酸》（Bacteriophage λ exonuclease and a 5′-phosphorylated DNA guide allow PAM-independent targeting of double-stranded nucleic acids）为题发在 Nature Biotechnology[1]。
北京化工大学博士生付胜男是第一作者，北京化工大学苏昕教授担任通讯作者。
后续，他们将基于现有 λExo 的性质开发更灵敏、更特异性、更快、更强的分子诊断方法，进一步改造 λExo 的结构，以实现基因干预、基因编辑应用。
参考资料：
1.Fu, S., Li, J., Chen, J.et al. Bacteriophage λ exonuclease and a 5′-phosphorylated DNA guide allow PAM-independent targeting of double-stranded nucleic acids. Nat Biotechnol (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02388-9
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