读博和博后期间，先后见证自己的导师成为诺奖得主。而自己则分别以一作身份，发表了一篇 Science 论文和 Cell 论文。
这便是浙江大学本科校友、美国加州理工学院博士毕业生陈凯的独特经历。
上述 Cell 论文，则正由他和自己的博后导师、美国加州大学伯克利分校教授珍妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna）以及其他同事联合完成。
研究中，他们着眼于蛋白结构-功能的相关性研究，并在分子层面上阐释了调控 Cas9 基因编效率的关键因素，将为开发新型基因编辑工具带来指导作用。
本次所提出的 CRISPR 基因编辑器改良策略，预计将会加快基因编辑工具的开发，以满足不同的应用需求。
在未来，他们也希望这一策略能被用于开发更普适、更高效的基因编辑系统。
缘何难以提升 Cas9 基因编辑效率？
据介绍，CRISPR 基因编辑系统由两个关键组分构成：向导 RNA（sgRNA）和 DNA 内切酶 Cas 蛋白。
其中，向导 RNA（sgRNA）的作用在于定位目标 DNA 序列。之后，由 DNA 内切酶 Cas 蛋白（比如 Cas9、Cas12）完成对于目标 DNA 序列的切割。
这套基因编辑系统如今已被广泛用于到各个方向的生命科学研究中，在治疗人类基因疾病上潜藏着巨大潜力。
正因如此，学界在过去十数年中不断挖掘自然界中天然存在的 CRISPR-Cas 体系，以用于开发能适用于不同范围的基因编辑工具。
与此同时，不少实验室也通过蛋白工程，来改造已知的 CRISPR-Cas 体系以便提升其性能，比如扩展目标序列的识别范围、降低脱靶风险等。
但是，在提升 Cas9 的基因编辑效率上，仍然缺乏有效的手段。
一方面，是因为人们依旧不清楚 Cas9 基因编辑效率的决定因素。
另一方面，在分子层面上人们对于 Cas9 蛋白结构也缺乏清晰认知，尤其不清楚到底怎样的结构变化才能提升 Cas9 的效率。
提出改造 Cas 蛋白楔形结构域的策略
长期以来，珍妮弗·杜德纳实验室致力于研究微生物免疫系统的生物化学、以及基于 CRISPR 的基因编辑工具的开发和应用。
在本次课题中，他们旨在研究 CRISPR 基因编辑器的性能，以及探索如何有效地改造基因编辑器，以便使之拥有更好的编辑效率。
因此，在该研究中他们着眼于来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的 Cas9 蛋白（即 GeoCas9）。
其具备良好的热稳定性，或能作为更好的基因编辑器。可惜的是，在哺乳动物细胞中的编辑中，GeoCas9 的效果很差。
此前，陈凯曾通过使用“定向进化”的策略，针对 GeoCas9 进行筛选改造，借此得到一个全新的突变体（即 iGeoCas9）。
这不仅大幅提升了基因编辑效率，也让热稳定性得到了保留。
对于蛋白的定向进化来说，它往往通过人为的随机突变和活性筛选，来得到活性更优的突变体。
在这整个定向进化过程中，尽管氨基酸的突变是随机的，但是陈凯特别关注到，对于效率提升起到最关键作用的有效氨基酸突变，往往集中在一个之前鲜少被注意的蛋白区域——楔形（WED，wedge）结构域。
基于此，在本次工作之中，他们针对两个版本的 GeoCas9（野生型和改造版），在蛋白结构、以及生物化学活性上的差异加以详细比较，尤其着眼在 WED 结构域的变化以及对蛋白功能的相应影响。
以 iGeoCas9 为例，WED 结构域上的 3 个氨基酸突变，会与目标双链 DNA 建立新的相互作用，从而增强与 DNA 的结合能力，进而让 iGeoCas9 能够识别更广泛的 DNA 序列。
然后，他们进一步比较两个 GeoCas9 的生物化学活性，并仔细探究了 Cas9 功能的每一个基元步骤、以及外在的影响因素。
借此发现：在 Cas9 功能的每一步之中，比如从最开始的 PAM 序列的识别、到对于目标 DNA 序列的初始弯曲、再到对于 DNA 双链的解旋，楔形结构域中的有效氨基酸突都能起到提升作用。
基于此，他们提出了改造 Cas 蛋白楔形结构域的策略，以便能够提升不同基因编辑器的效率，并在不同 Cas9 蛋白上均获得成功。
例如，他们将类似的 WED 结构域突变引入其他 Cas9 蛋白中，结果发现类似的氨基酸突变，同样能将基因编辑效率提升百倍以上。
该团队也预见了这一蛋白改造策略将能被更广泛的用于提升其他不同基因编辑器的效率。
日前，相关论文以《DNA 快速解旋加速了基因组编辑》（Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9）为题发在 Cell[1]。
陈凯是共同第一作者，珍妮弗·杜德纳担任通讯作者。
读博和博后期间，先后见证两位导师成为诺奖得主
陈凯表示：“这个课题是非常符合我个人的科研逻辑。”
他将这套逻辑建立于以下两点：
其一，实现新的发现，改变人们对于一些科学问题的认知（理论）；
其二，打造新的工具，改变人们研究科学的方法（应用）。
他表示：“我在上一个课题中发展了新的工具，改造了新的 Cas9 蛋白，并将其用于开发新的基因编辑器，同时拓宽了下游疾病治疗相关应用。”
而在本次课题之中，他回归到理性理解的角度，通过探究新的规律，并将其回馈于工具的开发。
“这也结合了我在读博时学到的蛋白工程和定向进化技能，如今我将它们用于我的博士后研究之中，让理论和应用得到了有机统一。”其表示。
如前所述，陈凯本科和博士先后毕业于浙江大学和美国加州理工学院。其中，大四时以化学专业第一名的成绩毕业。
读博期间，陈凯以第一作者身份发表的 Science 论文，首次展现了使用定向进化策略改造的天然酶可以获得非天然的功能，用以合成具有高张力能的小分子化合物。
2018 年，在自己读博期间，陈凯的博士导师弗朗西丝·阿诺德（Frances H. Arnold）获得诺贝尔化学奖。在诺奖发布会报告以及阿诺德教授的诺奖报告中，陈凯的工作均被引用。
2020 年，陈凯加入加州大学伯克利分校从事博后研究。“在这里我又一次见证了导师获得诺贝尔化学奖，实属人生幸事。”他说。
目前，他在博后期间已经主导完成了多个课题，包括新型基因编辑器的开发和改造、基因编辑器递送策略的发展和创新、以及将基因编辑用于基因疾病治疗的相关应用研究等。
而在未来，他也希望进一步地开发基因编辑工具，并将其更好地用于治疗基因疾病之中。
参考资料：
1.Eggers, A. R., Chen, K., Soczek, K. M., Tuck, O. T., Doherty, E. E., Xu, B., ... & Doudna, J. A. (2024). Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9.Cell, 187(13), 3249-3261.
排版：溪树
