当前蛋白质组基因组学在解析基因表达复杂性方面面临重大挑战。为此，研究人员开发了 moPepGen——一种基于图结构的算法，能够在保持线性计算复杂度的同时，全面生成非典型肽段（non-canonical peptides）。moPepGen 可灵活适用于多种测序和质谱技术，覆盖不同物种，并支持对各种基因组和转录组变异的解析。在人类癌症样本中，moPepGen 成功揭示了大量先前未被观测到的非典型肽段，这些肽段来源于种系与体细胞突变、非编码开放阅读框（ORF）、RNA 融合与环化等事件，展示了其强大的跨平台、跨物种、多模态整合能力。

一段 DNA 序列可以通过多种机制生成多样化的蛋白质产物。这些机制包括基因组变异（如点突变、插入缺失）、转录过程中的可变剪接、RNA 编辑、RNA 融合以及翻译后修饰等。RNA 环化更进一步扩展了编码潜力，使非线性模板也参与蛋白翻译过程。由于上述层级组合方式呈指数增长，蛋白质组学技术即便快速发展，仍然难以覆盖全部蛋白形式，尤其是那些不属于标准蛋白数据库的非典型肽段。

当前检测这类肽段的常用方法包括从头序列推断（de novo sequencing）与开放式搜索策略。然而，这些方法往往计算代价高、误报率或漏检率居高不下，数据解释和变异定位也较为困难。因此，主流蛋白质组研究转向构建样本特异性数据库，以结合 DNA 和 RNA 层面的变异信息来缩小搜索空间、提高检测灵敏度。

然而，构建这类数据库的关键在于是否能准确模拟转录、翻译和肽段剪切的复杂过程，并穷尽性地生成潜在蛋白产物。已有方法多数仅处理某一类突变或某种类型的剪接事件，导致假阴性比例升高，甚至在数据库缺失目标肽段时产生误检。为克服上述限制，研究人员提出了 moPepGen 框架，借助多层图结构模型，系统性整合所有变异组合，并生成更全面的非典型肽段数据集。

moPepGen 将每个转录本构建为三种互补图结构：转录本变异图（TVG）、肽段变异图（PVG）和肽段剪切图（PCG）。通过整合各种小变异（如 SNP、indel、RNA 编辑位点），以及非典型转录本骨架（如新ORF、融合转录本、RNA环化等），该框架可系统性地遍历所有可能的变异组合，并模拟肽段的翻译与酶切。

研究人员首先通过百万次模糊测试验证 moPepGen 在模拟环境下的准确性，结果显示其输出与理论穷举算法完全一致，同时具备线性时间复杂度。

研究人员进一步将 moPepGen 与现有两个自定义数据库生成工具 customProDB 和 pyQUILTS 进行对比，使用五例前列腺癌样本的多组学数据进行评估。在处理基础突变（如种系与体细胞点突变、indel）时，三者性能相近，但 moPepGen 在复杂生物学场景（如可变剪接、RNA编辑、环化、融合等）下是唯一能全面建模所有类型变异的工具，准确率与敏感性明显优于其他方法。值得注意的是，超过 80% 的非典型肽段为 moPepGen 独立预测，仅有 3% 未被其识别，这部分由其他工具所作生物假设所致。

研究人员在多个真实样本中展示了 moPepGen 的实用性：

酶切多样性分析：在人类扁桃体深分级样本中，使用七种不同蛋白酶处理，moPepGen 成功检测到 1,787 个来自非编码转录本的新 ORF 肽段，其中 Arg-C 表现最佳，显示不同酶切方案可辅助提升检测覆盖率。

小鼠蛋白质组应用：在小鼠 C57BL/6N 模型中，moPepGen 基于种系变异信息生成并识别了共计超过 20,000 个非典型肽段（包括编码区与非编码区 ORF），其中在脑、肝、子宫组织中共检测到 343 个非编码 ORF 肽段，证明其跨物种适应性。

癌症细胞系：在 375 个人类癌症细胞系中，moPepGen 平均为每个样本生成 2,683 个候选肽段，并检测到平均 39 个，涉及 TP53、KRAS、HRAS 等关键癌基因。部分肽段可作为潜在新抗原，在多细胞系中重复出现，暗示其功能重要性。

数据非依赖采集（DIA）质谱：在透明细胞肾癌样本中，研究人员检测到超过 300 个变异肽段，主要来源为种系 SNP 和可变剪接，RNA 编辑事件也占一定比例，验证了该方法在 DIA 数据中的可行性。

前列腺癌样本分析：在五例深度测序的前列腺癌样本中，moPepGen 生成了超过 130 万个独特肽段，涵盖 115 种组合类别，检测到超过 200 个非典型肽段。其中一些肽段源自 KLK3（前列腺特异抗原）中的双突变区域，部分肽段由 circRNA 导致的反向剪接生成，在多个肿瘤样本中复现，说明其潜在的生物学意义与通用性。

moPepGen 提供了一种高效、全面的非典型肽段生成与识别方案，突破了当前蛋白质组基因组学在突变整合和数据覆盖方面的瓶颈。其核心优势包括：

高通量与可扩展性：可在常规计算资源上线性扩展至全基因组级别。

变异整合能力强：覆盖基因组与转录组多种类型变异，包括复合型变异与非编码来源。

跨平台适应性广：可适配不同的质谱平台、酶切方案和物种背景。

算法可解释性强：输出肽段均附带来源注释，便于溯源和交叉验证。

综上所述，moPepGen 作为一项新兴工具，能为变异肽段检测、癌症新抗原识别、非编码蛋白翻译研究等提供有力支持，有望广泛应用于基础研究、肿瘤免疫治疗靶点发现、以及大规模多组学数据库构建中。

整理 | WJM

Zhu, C., Liu, L.Y., Ha, A. et al. Identification of non-canonical peptides with moPepGen. Nat Biotechnol (2025). 

https://doi.org/10.1038/s41587-025-02701-0